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Aislamiento de protoplastosa partir de mesofilo de Dioscorea alata c.v. pico de botella

Resumen

Un protoplasto vegetal es una célula que carece de pared celular, se encuentra rodeada por su membrana plasmática y es potencialmente capaz de regenerar la pared celular, crecer y dividirse. Los protoplastos son una herramienta fundamental para muchas investigaciones de biología básica y aplicada entre ellas, la obtención de clones resistentes a diversos patógenos fitosanitarios. Los protoplastos de Di"oscorea alafa (c.v. Pico de Botella) fueron aislados de células del mesofilo de vitroplantas por medio del método mecánico, realizando plasmolisis en solución de sacarosa 0.7M, seguida de maceración, filtración, centrifugación y lavado en solución de sacarosa 0.4 M; de igual manera, se utilizó el método enzimático, combinando cuatro concentraciones de Celulasa onozuka R1O (O.O, 0.5, 1.0 y 1.5%), con cuatro concentraciones de Macerozima R1O (O.O, 0.2, 0.4, 0.5%), a tiempos de incubación de 6, 1O, 14 y 18 horas y un pH de 5.6. Para lo cual se incubaron aproximadamente 0.015 gramos de hoja en medio de aislamiento de protoplastos de ñame (MAPÑ) a una temperatura de 27± 2ºC, agitado a 40 r.p.m. en agitador rotatorio, seguido de lavado en MAPÑ sin enzimas, purificación en sacarosa al 24 % y resuspension en medio de cultivo de protoplastos de ñame (MCPÑ); la viabilidad de los protoplastos aislados se evalúo por tinción con azul de Metileno 0.01% y fue confirmada a través de cultivo en medio MCPÑ liquido y en MCPÑ solidificado con 5g/L de agar. La mayor cantidad de protoplastos viables se obtuvo combinando 0.5 % de Celulasa Onozuka R10 con 0.2 % de Macerozima R10 y un tiempo de incubación de 14 horas, con un promedio de 1.95 x 105 protoplastos viables por mililitro, equivalente a 13 x 106 protoplastos por gramo de tejido. Los análisis de regresión de los datos obtenidos arrojaron, que las condiciones óptimas para obtener la mayor cantidad de protoplastos viables corresponden a una combinación de 0,97 % de Celulasa onozuka R10 y 0,36 % de Macerozima R10 y un tiempo de incubación de 13,82 horas con un máximo estimado de 262923 protoplastos/mL (equivalente a 17,5 x 106 protoplastos/gramo de tejido). Por el método mecánico se aisló en promedio 3.3 x 103 protoplastos viables/mL (equivalente a 22 x 104 protoplastos/gramo de tejido), lo que deja ver las bondades del método enzimático para el aislamiento de los mismos, sin embargo, ambos procesos nos permiten aislar protoplastos viables, con capacidad de regenerar su pared celular, crecer, dividirse y formar microcolonias y microcallos, observandose la formación de microcolonias a partir de los 8 dias en cultivo liquido y la formación de microcallos a partir de las 5 a 6 semanas de cultivo en medio sólido.